Mikrobiyolojik Ekim

Mikrobiyolojik Ekim, Sayım ve Boyama Yöntemleri

MİKROORGANİZMA EKİM YÖNTEMLERİ ve SAYIMI:
Tanım: Gıda maddesi üzerinde bulunan mikroorganizmaların sayılarının belirlenmesi amacıyla yapılan ekim işlemidir.
Gıda Bilimi ve Endüstrisi ile İlişkisi: Bir gıda maddesinde mikroorganizma sayısı belirlenerek o gıdanın gıda tüzüğünde belirtilen değerlere uygunluğunun saptanarak, sağlıklı olup olmadığı belirlenir.
Gıda Örneklerinde Toplam Bakteri Sayımı:
Özet:
Bu yöntem fermente gıdalar gibi doğal niteliği yönünden yüksek sayıda mikroorganizma içerenler dışında bir çok gıdada kalite kriteri olarak kullanılır. Yöntemlerde belirtilen besi ortamlarına ekilen gıda örneği seyreltimleri belli süre ve sıcaklıkda, aerobik koşullarda inkübe edilir. Toplam bakteri sayımında, dökme ve yayma plak teknikleri gibi kültürel sayım yöntemleri kullanılır.
1. Dökme Plak Yöntemiyle Toplam Bakteri Sayımı:
Materyal:
• Mikroskop
• Otoklav
• Etüv(220°C’ye kadar ayarlanabilir)
• Su banyoları
• Stomacher veya blender
• Bunzen beki
• Steril pens
• Tüp karıştırıcı
• Steril drigaski , özeler
• Cam veya plastik steril petriler
• Steril pipetler
• Deney tüpleri ve tüp taşıyıcıları
• Erlen, beher
• Plate Count Agar(PCA),EMB
• Mercimek
Metot:
Ø 10g gıda maddesi tartılır ve 90ml fizyolojik su içine konur. Bu karışım stomacher’de homojenize edilir. Bu dilisyon –1 dilisyonudur.
Ø –1 dilisyonundan 1ml alınır ve içinde 9 mlt fizyolojik su bulunan deney tüpüne aktarılır. Bu –2 dilisyonudur.
Ø –2 dilisyonundan 1 ml alınarak içinde 9 ml fizyolojik su bulunan deney tüpüne aktarılır. Bu –3 dilisyonudur.
Ø Üzerlerine seyreltim değerleri yazılmış petri kutularına –1,-2,-3 dilisyonlarından 1’er ml konulur. Petriler üzerindeki numaralar seyreltim numaraları ile aynı olmalıdır.
Ø Agarlı besi ortamı kaynar su banyosunda 45°C’ye kadar soğutulur. Her petriye 15-20 ml besi yeri dökülür.
Ø Petrilere hafif salınım hareketi verilerek örnek ile besi yerinim karışması sağlanır.
Ø Besi ortamı katılaştıktan sonra petriler ters çevrilerek 25°C’ de 24-48 saat inkübe edilir.

Kullanılan Çözeltiler:
Plate Count Agar (PCA):
Trypton 5 gr
Yeast agar 2,5 gr
Glukose 1 gr
Agar 15 gr
Destile su 1 lt

Eosin Methylen Blue Agar (EMB):
Pepton 10 gr
Laktoz 10 gr
K2HPO4 2 gr
Agar 15 gr
Eosın Y 0,4 gr
Methylen Blue 0,065gr
Destile su 1 lt
2. Yayma Plak Yöntemiyle Toplam Bakteri Sayımı:
Materyal:
Gerekli cihaz ve malzemeler dökme plak yönteminde anlatıldığı gibidir. Yalnız burada besi yeri olarak DRBC agar kullanılır. Bu besi yeri ile küfler sayılır.
Metot:
Ø –1,-2,-3 dilisyonları daha önce anlatıldığı gibi hazırlanır.
Ø Boş petrilere 15-20 mlt besi yeri dökülür. Besi yerinin donması beklenir ve üzerine her dilisyondan 0,1 er mlt pipetle aktarılır.
Ø Petrilere 0,1 er mlt örnek koyulduğu için bir kez daha seyreltim yapılmış gibi sayılır ve petrilere koyulan seyreltim derecesinden bir düşük sayı ile numaralandırılır:-1® -2
Ø Koyduğumuz örnekleri drigaski ile agarın yüzeyine yayarız.
Ø 25°C de 5-7 gün inkübe edilir.

Kullanılan Çözeltiler:
DRBC Agar:
Glukoz 10 gr
Bakteriyolojik pepton 5 gr
KH2PO4 1 gr
MgSO4.7H2O 0,5 gr
Rose bengal 0,5 mlt
Dikloran 1 mlt
Kloram fenikol 0,1 gr
Agar 15 gr
Damıtık su 1000 mlt

3. Direkt Ekim Yöntemi:
Materyal:
• Malt Extract Agar(MEA)
• Nohut
• Diğer materyaller daha önceki yöntemlerde kullanılan materyallerdir.

Metod:
Ø Behere 50 gram nohut konur. Üzerini kaplayacak kadar %4’lük NaOCl ile 1 dakika boyunca çalkalanır.
Ø Daha sonra bu çözelti dökülüp nohutlar beher içinde steril su çalkalanır.
Ø Steril su dökülüp tekrar steril su eklenir, çalkalanır ve dökülür.
Ø Beş adet nohut steril bir pensle alınıp dikkatli bir şekilde besi yerine konulur. Nohutların petri kutusu içinde kaymamasına, birbirlerine değmemesine ve besi yerinin nohutlar dikilirken yırtılmamasına özen gösterilmelidir.

Kullanılan Maddeler:
Malt Extract Agar:
Malt Extract 30g
Agar 20g
Destile su 1 lt


Mikroorganizma sayısının belirlenmesi:
Petri kutusunda sayım yaparken bakteriler ve mayalar için 25-250 koloni gelişmiş petriler seçilirken, küfler için ise 10-25 koloni gelişen petriler seçilir. Mikroorganizma sayısı aşağıdaki formül ile bulunabilir:
Mos. sayısı (cfu/g) = Petrideki koloni sayısı * petri kutusuna ekilen miktar (ml) /seyreltme oranı

Hata Kaynakları:
• Dökülen besi yerlerinin petri kutusuna iyi dağıtılamaması.
• Katı parçacıklar bulunan besi yeri dökülmesi.
• Yeterli seyreltme yapılamaması.
• Sayım yaparken dikkat edilmemesi.