Bitki Doku Kültürü

Bitki Doku Kültürü

Bitki doku kültürü; aseptik şartlarda, yapay bir besin ortamında, bütün bir bitki, hücre (meristematik hücreler, süspansiyon veya kallus hücreleri), doku (çeşitli bitki kısımları=eksplant) veya organ (apikal meristem, kök vb.) gibi bitki kısımlarından yeni doku, bitki veya bitkisel ürünlerin (metabolitler gibi) üretilmesidir. Yeni çeşit geliştirmek ve mevcut çeşitlerde genetik varyabilite oluşturmak doku kültürünün temel amaçları arasında sayılabilir. Bu nedenle bitki doku kültürleri genetiksel iyileştirme çalışmalarında önemli bir rol oynamaktadır. Ayrıca kaybolmakta olan türlerin korunmasında ve çoğaltılması zor olan türlerin üretiminde, çeşitli doku kültürü yöntemleri rutin olarak uygulanmaktadır (Babaoğlu ve ark., 2001-Bitki Biyoteknolojisi Cilt I-Doku Kültürü ve Uygulamaları- Bölüm 1. Temel Laboratuvar Teknikleri).

Bitki doku kültürü işlemlerinde ve genetik iyileştirmelerde kullanılan temel sistem bitki rejenerasyonu yani bitkinin hücre, doku ve organlarından klonlanmasıdır. Bitki rejenerasyonu, kültürü yapılan hücrelerin özellikleri itibariyle üç kısımda incelenebilir; 1) organize olmuş meristematik hücreleri ihtiva eden somatik dokulardan rejenerasyon, 2) meristematik olmayan somatik hücrelerden rejenerasyon ve 3) mayoz bölünme geçirmiş gametik hücrelerden rejenerasyon. Birinci tip rejenerasyonda uç ve yan meristemlerden bitkiler çoğaltılır. Buna meristem kültürü yoluyla klonal çoğaltım denilir. Elde edilen hücreler tamamen donör (verici) bitkiye benzerler. İkinci tip rejenerasyon; doğrudan bir bitki parçasının (eksplant denilir) kesilmiş yüzeylerindeki belirli somatik hücrelerin bir kısmının genellikle besin ortamına ilave edilen bitki büyüme düzenleyicilerinin (özellikle oksin ve sitokininler) etkisiyle bölünerek ve organize olarak, organları ve daha sonra da bitkiyi (direkt organogenesis) veya bir somatik hücrenin sürekli bölünerek embriyo ve daha sonra da tam bir bitkiyi oluşturması (direkt somatik embriyogenesis) şeklinde olabilir. Ayrıca her iki durum, belirli bir kallus, proto-kallus veya hücre süspansiyonu oluşumu devresinden sonra da ortaya çıkabilir (indirekt rejenerasyon). Ortaya çıkan bitkilerde bazı kalıtsal veya geçici varyasyonlar oluşabilir. Son olarak normal kromozom sayısının yarısını ihtiva eden hücrelerden de direkt veya dolaylı yollarla bitki rejenerasyonu olabilir. Bu durumda donör bitkinin kromozom sayısının yarısına sahip, genellikle steril olan haploid bitkiler elde edilebilir. Bu bitkicik, doku veya hücrelerde kromozom katlaması yoluyla fertil (dihaploid veya katlanmış haploid) bitkiler elde edilir.



Tablo: Bitki doku kültüründe önemli çalışmalar (Pierik, 1993; Kung, 1993; Endress, 1994).
Tarih Çalışmalar Araştırmacılar
1902 İlk izole edilmiş hücre kültürü Haberlandt
1904 Olgun embriyoların kültürü Hanning
1917 Biyoteknoloji teriminin ilk defa kullanımı Karl Ereky
1920 Oksinin tanımlanması Went ve ark.
1922 Kök ve sürgün uçlarının laboratuvarda çoğaltımı Kotte ve Robbins
1924 İlk embriyo kurtarma tekniği (mısır) Dieterich
1934 İlk sürekli kök kültürleri (domates) White
1934 İlk kallus kültürleri Gautheret
1942 İlk kallus kültürlerinden sekonder metabolit eldesi Gautheret
1946 Sürgün uçlarından (apikal meristem) ilk bitki eldesi Ball
1953 DNA'nın yapısının belirlenmesi Watson ve Crick
1954 Hücre süspansiyonlarından ilk bitki eldesi Muir ve ark.
1957 İlk sitokininin tanımlanması ve organ oluşumunda sitokinin/oksin oranının öneminin ortaya konulması Skoog ve Miller
1958 İlk somatik embriyogenesis (havuç) Steward ve ark.
1960 Enzimler kullanılarak ilk canlı protoplast izolasyonu Cocking
1962 MS besin ortamının geliştirilmesi Murashige ve Skoog
1965 Tek hücreden bitki rejenerasyonu Vasil ve Hilderbrandt
1967 İlk haploid bitkinin üretimi (anter polen kültürü) Bourgin ve Nitsch
1968 B5 ortamının geliştirilmesi Gamborg ve ark.
1970 HEPA filtrelerin kullanılmaya başlanması
1971 Protoplastlardan ilk bitki rejenerasyonu Nagata ve Takabe
1978 Cinsler arası ilk somatik melezleme Melchers ve ark.
1983 Transgenik ilk bitkinin elde edilmesi (tütün) Murai ve ark.
1986 Transgenik ilk bitkinin tarla testleri (tütün) -
1990 Sentetik tohum geliştirme ve hızlı dondurma yoluyla germplazm muhafazası çalışmalarının başlaması -
1995 İlk rekombinant insan gıdası (Flavr Savr, domates)

Babaoğlu ve ark., 2001-Bitki Biyoteknolojisi Cilt I-Doku Kültürü ve Uygulamaları- Bölüm 1. Temel Laboratuvar Teknikleri).



Bitki doku kültürlerinin bitki ıslahındaki uygulama alanları

Türler arası melezlemelerden sonra embriyo kültürü: Zigot oluşumundan sonra ortaya çıkan (post-zigotik) uyuşmazlıklar in vivo melezlemelerde embriyo oluşumunu veya oluşan embriyoların yaşamalarını engellemektedir. Bu embriyolar özel besin ortamlarında doku kültürü ile geliştirilmekte ve yeni melez bitkiler elde edilebilmektedir. Bu tekniğe embriyo kurtarma tekniği denilmektedir (bkz. Bitki Biyoteknolojisi Cilt I, Bölüm 10).

Haploid bitki üretiminde anter (polen) ve yumurtalık (ovül) kültürü: Özellikle kendine döllenen bitkilerde yapılan klasik bitki ıslahı melezlemeleri sonrası, hatların saflaştırılması (homozigotlaşması) uzun zaman almaktadır. Mayoz bölünme geçirmiş haploid sayıda kromozoma sahip hücrelerde (polen/mikrospor veya megaspor) veya bu hücreleri ihtiva eden bitki kısımlarının (anter veya yumurtalık) doku kültürü yoluyla elde edilen hücrelerinde veya rejenerantlarında yapılan kromozom katlanması sonucu %100 homozigot bitkiler elde edilebilmektedir. Bu tekniğe in vitro haploidi tekniği denir (Maheswari ve ark., 1995) (bkz. Bitki Biyoteknolojisi Cilt I, Bölüm 5).

Somaklonal varyasyon: Kallus oluşturan veya totipotent olup yeni bitkiler meydana getirebilen hücreler uzun süreli kültürlerde veya kısa süreli de olsa yüksek bitki büyüme düzenleyicileri içeren ortamlarda bu yeteneklerini (kompotens) yitirebilmektedirler. Bu hücrelerden oluşan yeni bitkilerde gen veya kromozom bozuklukları sonucu kalıtsal ve fenotipik varyasyonlar (somaklonal varyasyon) ortaya çıkmaktadır. Bu varyasyonlar, yeni çeşit geliştirme ve iyileştirmelerde ıslahçılar tarafından kullanılmaktadır (Chrispeels ve Sadava, 1994). Somaklonal varyasyon sonucu ortaya çıkan değişiklikler arasında, bazı pigmentlerin yapısındaki farklılaşmalar sonucu çiçek renginin, yaprak ve çiçek morfolojisinin, tohum veriminin, bitki canlılığı ve iriliğinin, uçucu yağ kompozisyonu ve hastalıklara tolerans veya dayanıklılığın değişmesi sayılabilir (Brown ve Thorpe, 1995) (bkz. Bitki Biyoteknolojisi Cilt I, Bölüm 11).

İn vitro seleksiyon: Tek hücre seviyesinde; tuz, herbisitler, patojenler vb. faktörlere karşı dayanıklılığa göre yapılan seleksiyonlar sonucu, bu hücrelerden elde edilen bitkilerde ilgili faktörlere dayanıklı veya toleranslı bitkiler ortaya çıkabilir. Bu tekniğe in vitro seleksiyon denilmektedir.

İn vitro döllenme: Bazı durumlarda (özellikle dış ortama alıştırılamayan bitkilerden tohum almak için) doku kültürü ile elde edilen bitkiler laboratuvar şartlarında tozlaştırılmaktadır. Fakat bu uygulama çok sınırlı kalmıştır.

İn vitro germplazm muhafazası: Totipotent hücrelerin in vitro kültürü, kallus veya süspansiyon hücreleri şeklinde uzun süreli olarak veya belirli aralıklarla yeniden oluşturularak saklanabilir ve ihtiyaç duyulduğunda bu hücrelerden yeni bitkiler oluşturulabilir. Alternatif olarak ilgili hücreler, meristemler veya elde edilen minyatür bitkiler düşük sıcaklıkta (4 0C), çok az besin maddesine ve alana ihtiyaç göstererek aseptik şartlarda saklanabilir (1-4 yıl). Benzer şekilde çok düşük sıcaklıklarda –196 0C), sıvı azot içinde doku ve hücreler hızlı bir şekilde dondurulup saklanabilirler. Bu doku kültürü teknikleri in vitro germplazm muhafazasında önemlidir ve gen ve tohum bankalarına alternatif oluşturmaktadır (Brown ve Thorpe, 1995) (bkz. Bitki Biyoteknolojisi Cilt I, Bölüm 9).

Somatik hücre melezlemesi (protoplast füzyonu): Protoplast füzyonu ve somatik melezleme, pre-zigotik eşeysel uyuşmazlıklar nedeniyle, klasik melezleme ile elde edilemeyen hibritlerin elde edilmesinde kimyasal ve fiziksel metotlar kullanılarak uygulanan bir tekniktir. Elde edilen somatik melez hücreden (heterokaryon), kallus oluşumu ve bitki rejenerasyonu yoluyla yeni bitkilerin elde edilmesi sistemin en önemli ve en gerekli parçasıdır. Bu işlem genel anlamda genetik kopyalamadır ve bitkilerde yaklaşık 30 yıldan beri uygulanmakta olup en başarılı örneği tütün bitkisinde görülmüştür (Ochatt ve Power, 1992) (bkz. Bitki Biyoteknolojisi Cilt I, Bölüm 4).

Gen transferi: Doku kültürlerinin bitkileri iyileştirmede en önemli ve yaygın olarak kullanılan uygulamalarından birisi de, gen veya genlerin bitkilere aktarılmasıdır. Bunun için mutlaka tekrarlanabilir bir hücre-bitki rejenerasyonu (organogenesis ve somatik embriyogenesis) sistemine ihtiyaç vardır (bkz. Bitki Biyoteknolojisi Cilt I, Bölüm 2, 3 ve 4).



Bitki doku kültürünün ticari ve ıslah dışı uygulamaları

Hastalıksız bitki elde edilmesinde meristem kültürü: Tüm apikal meristem veya buradan alınan küçük embriyonik parçalar kültüre alınarak uygulanan tekniğe meristem kültürü denir. Çok az miktarlarda bitki büyüme düzenleyicileri ilave edildiğinde uç ve yan meristemlerden birçok yeni bitkicikler elde edilebilmektedir. Bu metotla elde edilen bitkiler her bakımdan birbirinin benzeridirler (bkz. Bitki Biyoteknolojisi Cilt I, Bölüm 6).

Mikroçoğaltım: Organize meristemlerden, henüz olgunlaşmamış veya olgunlaşmasını tamamlamış somatik hücrelerden direkt (organogenesis veya somatik embriyogenesis) veya indirekt (kallus, protoplast vb.) yollarla bitkilerin çoğaltılması ve köklendirilmesi işlemine genel olarak mikroçoğaltım denilmektedir. ABD'de doku kültürünün ticari uygulaması 1970' de başlamış (orkidelerde ve süs bitkilerinde) ve bu yolla elde edilen ürünlerin pazar değeri bu gün yılda 15 milyar dolara ulaşmıştır. Daha az sürgün elde edilmesine rağmen uç ve yan meristemlerden kitle çoğaltım ticari olarak diğerlerinden daha fazla kullanılan bir metottur (Brown ve Thorpe, 1995) (bkz. Bitki Biyoteknolojisi Cilt I, Bölüm 8). Aşağıda bir videoda ticari doku kültürü üretim laboratuvarından görüntüler vardır. Benzer konularda diğer videolar da görülebilir. Tüm çalışmalar steril şartlarda laminar hava akışlı kabin içinde yapılmaktadır.







Sentetik tohum üretimi (somatik embriyolar): Somatik embriyoların çeşitli metotlarla kaplanması sonucu sentetik (yapay) tohumlar elde edilmektedir. Sentetik tohumların, hibritlerin somatik çoğaltımında, erkısır ve ebeveyn hatların muhafazasında ve odunsu bitkilerin elit genotiplerinin elde tutulmasında kullanımı konusunda oldukça fazla çalışma yapılmaktadır.

Sekonder metabolit üretimi (kallus-hücre süspansiyonları): İn vitro hücre kültürleri sekonder metabolit üretiminde de önemli bir kaynak olarak görülmektedir. Bitki sekonder metabolitleri, bitki büyüme ve gelişmesinde doğrudan kullanılmayan maddelerdir. Işık mikroskobu ile görülebilen sekonder metabolitlerin (tanenler, antosiyaninler, karetenoitler) yanında UV ışığı ile görülebilenleri (alkaloitler) de vardır. Son yıllarda sekonder metabolit üretimi için ot verimi yüksek, çok yıllık, geniş adaptasyon kabiliyetine sahip ve azotlu gübre kullanımı oldukça az olan yonca, alternatif bir bitki olarak gösterilmektedir. İlgili enzim alındıktan sonra yoncanın geriye kalan kısmı ot olarak kullanılabilir (Austin, 1997) (bkz. Bitki Biyoteknolojisi Cilt I, Bölüm 7).

Kimeralar: Doku kültüründe, özellikle süs bitkilerinde üzerinde önemle durulan konulardan birisi de kimeralardır. Kimerik bitkiler; farklı türlerin protoplastlarının karışık kültürü ve bitki rejenerasyonu, mutasyon uygulamaları sonucu bitki rejenerasyonu çalışmaları, apikal meristemle ilgili yapılan mikro-cerrahi çalışmaları ve gen transferi yapılması sırasında, bir bitkiyi oluşturan bütün hücrelerin ilgili gen veya genleri taşımaması durumlarında (özellikle partikül bombardımanı metodu ve apikal meristemler kullanıldığında) elde edilebilmektedir.



Bitki doku kültürlerinin temel araştırmalardaki uygulamaları

Doku kültürü, protoplast izolasyonu ve füzyonu, hücre, doku ve bitki beslenmesi, sitogenetik çalışmalar, morfogenesis çalışmaları ve biyolojik azot fiksasyonu gibi temel araştırmalarda da kullanılmaktadır. Bu tür araştırmalar genellikle sistem geliştirmede faydalı olmaktadır.





Doku Kültüründe Temel Teknikler

Doku kültürü işlemleri bir çok aşamadan oluşmaktadır. Bunlar: 1) Uygun bir laboratuvar düzeninin kurulması, 2) Kullanılacak bitki parçalarının (eksplant) ve besin ortamlarının seçimi, hazırlanması ve sterilizasyonu, 3) Kallus ve hücre süspansiyonlarının oluşturulması, 4) Kallus veya hücre süspansiyonlarından veya doğrudan somatik veya gametik hücrelerden bitki rejenerasyonunun uyarılması (organogenesis, somatik embriyogenesis veya meristem çoğaltımı yoluyla), 5) Oluşan sürgünlerin çoğaltılması ve boylarının uzatılması, somatik embriyoların olgunlaştırılması, 6) Uzayan sürgünlerin köklendirilmesi, 7) Köklenen bitkilerin dış ortama alıştırılması (aklimatizasyon). Bunlar arasında en önemlisi, uygun laboratuvar imkanlarının sağlanmasıdır.

Doku Kültüründe en önemli konu steril işlemleri yapabilecek bazı temel alet ve ekipmanlara veya iyi bir laboratuvara sahip olmak gerekmektedir. Doku kültüründe en temel konular bitki parçaları ve kullanılacak alet ekipmanların iyice temizlenmesi (sterilizasyon), besin ortamlarının hazırlanması ve kültüre alınacak yerin belirlenmesidir.

Tablo: Bir laboratuvarda bulunması gerekli olan imkanlar (Smith, 1992; Gamborg ve Phillips, 1995).

· Alev lambası

· Alüminyum folyo

· Ambalaj filmi (naylon)

· Analitik elektronik terazi

· Aspiratör

· Basınçlı hava kompresörü veya kaynağı

· Beherler (250 ml, 500 ml, 1 litre, 2 litre, 5 litre)

· Bisturi

· Buhar banyosu (100 C ye kadar ayarlanabilen)

· Buzdolabı (derin donduruculu)

· Cam kavanozlar (cam şişe), muhtelif reçel ve konserve kavanozları (100, 150, 200, 500 ml)

· Dereceli silindirler (20 ml, 50 ml, 100 ml, 200 ml, 500 ml, 1 litre, 2 litre)

· Dolaplar

· Erlenler (100, 250 ml, 1, 2, 4 litre kapasiteli en az bir tanesi ölçülü ağızlı)

· Etüv

· Fayanslar (10x10, 15x15 cm, en az 20 adet)

· Filtre sterilizasyonu için filtre üniteleri

· Floresan ışığı (serin-beyaz) ile aydınlatılan ve sıcaklığı ayarlanabilen kültür odası

· Fotoğraf filmi (siyah-beyaz ve renkli, slayt için)

· Gaz kaynağı (doğal gaz)

· Isıtıcılı manyetik karıştırıcı

· Kağıt havlular

· Kauçuk eldivenler

· Laminar hava akışlı kabin (HEPA filtreli)


· Mikrodalga fırın

· Mikro pipetler (Gilson vb.) 1-5 ml, 5-20 ml, 20-50 ml, 50-200 ml, 200-1000 ml arası ayarlanabilen çeşitli hassasiyette.

· Mikroskoplar (stereo; büyütmeli ve ışık kaynaklı)

· Otoklav, basınçlı pişirici ve otoklav eldivenleri

· Otomatik pipet

· Pastör pipetler (arkası pamuklu, 15-23 mm uzunluğunda)

· Pensler (4, 7, 8 inç) ikişer adet

· Petri kapları (5, 7, 9, 14 cm cam veya tek kullanımlık plastik)

· pH metre

· Pipet doldurucu

· Pipet memeleri

· Pipet pompası (20 ml, mekanik veya otomatik)

· Pipet yıkayıcı

· Pipetler (1, 5, 10 ml, tek kullanım için veya cam)

· Plastik fide dikim kapları

· Raflar

· Raklar

· Saf alkol

· Saf su ünitesi (su demineralizasyon ünitesi tercih edilmelidir).

· Çalkalayıcı (yatay-horizontal)

· Santrifüj (makro-mikro)

· Sprey şişesi ve şişeler

· Test tüpleri (25 x 100 mm)

· Tripod

· Vakum pompası