Boyama Yöntemleri ve Mikroorganizmaların Boyanması

Mikroorganizmaların pek çoğu renksiz olduklarından normal ışık mikroskobu ile görülmeleri zordur. Mikroorganizmaların mikroskopta görünür hale getirilmesi için preparat hazırlandıktan sonra uygun boya çözeltileriyle boyanmaları işlemine “mikroorganizmaların boyanması”denir.
Boya bir benzen halkasına bağlı kromofor ve okzokrom gruplarını taşıyan organik bir bileşiktir. Kromofor grup moleküle renk özelliği verir, ancak bu bileşik renkli olmasına rağmen henüz boya karakterinde değildir. Bu maddenin herhangi bir ortama tutunma özelliği yoktur. Bu özellik okzokrom grubu ile sağlanır. Okzokrom grubu moleküle elektrolitik çözünme özelliği vererek tuz meydana getirilmesini sağlar. Okzokrom grubu boyanın renk tonunu değiştirebilir. Ancak rengin ortaya çıkmasını sağlayamaz.
Boya Çeşitleri:
• Bazik Boyalar: Bazik fuksin, Kristal violet, Metilen mavisi, Safranin.
• Asit Boyalar : Nigrosin, Eosin, Asit fuksin.
• Nötr Boyalar : Giemsa, Leishman
Gıda Bilimi ve Endüstrisi ile İlişkisi:
Boyama yöntemleri ile mikroorganizmaların sınıflandırılması ve tanımlanması, genel olarak şeklinin gözlenmesi mümkündür. Boyama ile bir gıda ürününün ekim işleminden sonra açığa çıkan kültürlerden şüphe duyulanların hangi mikroorganizmalar olduğu belirlenir. Böylece insan sağlığı açısından güvenilir bilgiler elde edilebilir. Ayrıca boya maddeleri mikroorganizmaların boyanmasının dışında başka amaçlar için de kullanılmaktadır. Örneğin trifenil içeren bazı boyalar bazı mikroorganizmalar üzerine öldürücü etkiye sahip olduklarından, mikroorganizmaların izolasyonunda besi yerine inhibitör ajan olarak ilave edilmektedir. Böylece istenmeyen mikroorganizmaların gelişmesini önleyerek besi yerine seçici özellik kazandırır.

Boyama Yöntemleri:
• Basit Boyama
• Gram Boyama
• Endospor Boyama
• Flagella Boyama
• Kapsül Boyama
• Küf Boyama

1. Gram Boyama
Tanım:
Mikrobiyolojide çok kullanılan bir yöntemdir. Bakteriler bu yöntemle iki gruba ayrılırlar. Mor-menekşe renge boyanmış mikroorganizmalar gram pozitif, pembeye boyananlar ise gram negatif olarak tanımlanırlar. Bazı mikroorganizmaların yaşlandıkça gram reaksiyonlarında değişiklik olabileceğinden 18-24 satlik genç kültürlerden hazırlanan preparatlar kullanılmalıdır.

Materyal:
• Lam
• Öze
• Besiyerinde bakteri kültürü (PCA petrisinde)
• Boya çözeltileri: Crystal violet, gramın iyot çözeltisi, safranin veya sulu fuchsin
• %95’lik etil alkol
• Kurutma kağıdı
• İmmersiyon yağı
• Mikroskop(100Xobj.)

Metod:
a)Preparat Hazırlanması:
Ø Temiz bir lam üzerine öze ile bir damla steril fizyolojik tuz çözeltisi damlatılır.
Ø Öze bunzen alevinde sterilize edilir,soğuması için kısa süre beklenir.
Ø Steril öze ile katı besiyerinden bir miktar kültür alınır.
Ø Kültür lam üzerine damlatılmış su ile karıştırılır.
Ø Öze bunzen alevinde sterilize edilip,yerine konur.
Ø Preparatın kuruması için bir süre beklenir.
Ø Bir pens yardımıyla bir ucundan tutulan lam bunzen aleviden 3 kere geçirilir.

b)Boyama Yöntemi:
Ø Uygulamada hazırlanan preparat üzerine crysal violet damlatılarak 1-2 dak. beklenir.
Ø Su ile hafifçe yıkanarak boyanın fazlası akıtılır.
Ø Lugol çözeltisi damlatılarak 1 dak. bekletilir.Sürenin sonunda Lugol çözeltisi akıtılır.
Ø Preparat %95’lik etil alkol ile yıkanır.(10-15 sn )
Ø Preparat, saf sudan geçirildikten sonra sulu carbol fuchsin çözeltisi ile 10-30 saniye boyanır.
Ø Damıtık su ile iyice yıkanır ve kurulama kağıdı ile hafifçe suyu alınır ve kurumaya bırakılır.
Ø İmmersiyon objektifi ile mikroskopta incelenir.

Kullanılan çözeltiler:
Crystal Violet Çözeltisi:
Crystal Violet 0.50 g
Damıtık Su 100.00 ml

Lugol çözeltisi
İyot 1.00 g
KI 2.00 g
Damıtık Su 300.00 ml

Carbol Fuchsin (Ziehl-Neelsen)
Basic fuchsin 1.00 g
Etanol (%95) 10.00 ml
Fenol (%5’lik çözeltisi suda) 100.00 ml

2.Küf Boyama:
Materyal:
• Lam
• Öze
• Küf kültürü
• Lactofenol
• %95’lik etil alkol
• Kurutma kağıdı
• İmmersiyon yağı
• Mikroskop
• Lamel

Metot:
Ø Temiz bir lam üzerine bir damla lactofenol çözeltisinden damlatılır.
Ø İğne uçlu öze ile spor yapısını içeren kültür bir miktar besiyeri ile birlikte alınarak çözelti üzerine konur.
Ø Üzerlerine bir damla alkol damlatılıp hava kabarcığı kalmayacak şekilde lamel kapatılır.
Ø Preparat mikroskopta incelenir.

Kullanılan Çözeltiler:
Lactofenol Çözeltisi:
Fenol (kristal) 20 g
Laktik Asit 20 g
Gliserol 40 g
Saf su 100 ml

Hata Kaynakları:
• Yeterli steril koşullarda çalışmama.
• Besi yerinden kültür alımına dikkat etmeme.
• Preparat alınırken kültürün lam üzerindeki su ile iyice karıştırılmaması.
• Mikroorganizmaların lam üzerine iyice fiksasyon edilmemesi.
• Damlatılan boyaların gereğinden fazla veya az damlatılması.
• Bekleme sürelerinin yeterli olmaması.
• Su ile yıkamada mikroorganizmaların kayıp olması.
• Kurutma kağıdının fazla bastırılması.
• Küf boyamada lamelin hava alacak şekilde kapatılması.

Ekler:
›Gıdadaki mikroorganizmaların tüm yüzeye yayılması için parçalama işlemi yapılır. Bu işleme homojenizasyon denir. Homojenizasyonda üç tip alet kullanılır:
-Stomacher: Dilüsyon sıvısı içinde bulunan maddeyi pedalları ile döverek parçalayıp sıvıya homojen olarak dağıtan alettir.
-Blender: İçinde bulunan bıçağın dönmesi sonucu homojenizasyon sağlayan alettir.
-Top drive homogenizer: Bıçağın üstten aşağıya dönerek inmesiyle homojenizasyon sağlayan alettir.

›Gram pozitif bakterilerin alkol ile muameleden sonra crystal violet-iyot kompleksini bırakmamalarının nedeni hücre duvarının özelliklerinden kaynaklanmaktadır. Gram-negatif bakterilerde ince bir peptidoglycan tabaka bulunur ve yağ oranı daha fazladır. Gram-pozitif bakterilerde ise peptidoglycan tabaka daha kalındır. Gram boyamanın uygulanmasından sonra oluşan crystal violet-iyot kompleksi, alkol ile yıkamada gram pozitif bakterilerde kalın peptidoglycan tabakadan çıkamaz ve hücre içinde kalarak hücrenin mor renkte görünmesine neden olur. Gram negatif bakterilerde ise alkol, hücre duvarının dışındaki lipopolisakarid tabakada delikler oluşturur. Böylece alkolden sonraki su ile yıkamada boya yıkanır ve gram negatif bakteriler başlangıçtaki şeffaf durumlarına dönerler. Bu aşamadan sonra bakteriler karşıt boya olan safranin ile boyandıklarında boyayı tuttukları için renkleri pembe-kırmızı görünür. Gram pozitif bakterilerde safraninin bir etkisi olmadığı için hücrenin renginde son olarak bir değişiklik meydana gelmez.

Sonuçlar ve Bulgular:
Dökme plak – PCA: 46.102
EMB: 1.102
Yayma plak – DRBC: 2.104
Direk ekim – MEA: Oğuzhan - %60
Nükhet - %80
Serli - %100
Serpil - %100